將克隆化基因插入合適(shi)載(zai)體后導入大(da)腸(chang)(chang)桿(gan)菌(jun)用于表(biao)達(da)大(da)量蛋(dan)(dan)白質的方法一般稱為原核(he)表(biao)達(da)。這種方法在蛋(dan)(dan)白純(chun)化、定(ding)位及功能分(fen)析等(deng)方面都(dou)有應用。大(da)腸(chang)(chang)桿(gan)菌(jun)用于表(biao)達(da)重組(zu)蛋(dan)(dan)白有以(yi)下(xia)特點：

易于生(sheng)長和控(kong)制；用于細(xi)菌(jun)培養(yang)的(de)(de)材(cai)料不及(ji)(ji)哺乳動物細(xi)胞系統的(de)(de)材(cai)料昂貴；有(you)各種各樣的(de)(de)大(da)腸桿(gan)菌(jun)菌(jun)株(zhu)及(ji)(ji)與之匹配(pei)的(de)(de)具各種特性的(de)(de)質粒可(ke)供(gong)選擇。但是，在大(da)腸桿(gan)菌(jun)中表(biao)達的(de)(de)蛋(dan)(dan)白由于缺少修飾(shi)和糖基(ji)化(hua)、磷(lin)酸化(hua)等翻譯后(hou)加工，常形(xing)成包涵體而影響(xiang)表(biao)達蛋(dan)(dan)白的(de)(de)生(sheng)物學活(huo)性及(ji)(ji)構象。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選擇標(biao)志的(de)編(bian)碼(ma)序列；

（2）可控轉錄的啟動(dong)子；

（3）轉錄調(diao)控序列(轉錄終止(zhi)子，核糖體(ti)結合(he)位(wei)點)；

（4）一個多限制酶切(qie)位點(dian)接頭(tou)；

（5）宿主體內自主復制的序(xu)列。

原核表達一般程序如下：

獲得目(mu)的(de)基因(yin)－準(zhun)備表達載(zai)體－將(jiang)目(mu)的(de)基因(yin)插入表達載(zai)體中（測(ce)序驗(yan)證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的(de)表達－表達蛋白的(de)分析－擴(kuo)增、純化、進(jin)一步檢測(ce)

一、試劑準備

1、LB培養基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中(zhong)，0.22μm濾膜(mo)抽濾，-20℃保存(cun)。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通(tong)過PCR方法(fa)：以含目的基(ji)(ji)因的克(ke)隆(long)質粒為模板，按基(ji)(ji)因序列設計一對引(yin)物(wu)（在(zai)上游(you)和下游(you)引(yin)物(wu)分別引(yin)入(ru)不同的酶切(qie)位點），PCR循環(huan)獲(huo)得所(suo)需基(ji)(ji)因片段(duan)。

2、通過(guo)RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為(wei)模板(ban)(ban)，逆(ni)(ni)轉(zhuan)錄形成cDNA第yi鏈，以逆(ni)(ni)轉(zhuan)錄產(chan)(chan)物為(wei)模板(ban)(ban)進行PCR循環(huan)獲得產(chan)(chan)物。

（二(er)）構建重組表達載體

1、載體(ti)(ti)酶(mei)(mei)切(qie)(qie)：將表達質粒用限制性(xing)內(nei)切(qie)(qie)酶(mei)(mei)（同引物的酶(mei)(mei)切(qie)(qie)位點）進行(xing)雙酶(mei)(mei)切(qie)(qie)，酶(mei)(mei)切(qie)(qie)產(chan)物行(xing)瓊脂糖電泳后(hou)，用膠回收Kit或凍融法(fa)回收載體(ti)(ti)大片(pian)段。

2、PCR產物雙酶(mei)切后回收，在(zai)T4DNA連接酶(mei)作用下連接入載體。

（三）獲得含(han)重組表達(da)(da)質粒(li)的表達(da)(da)菌種

1、將連(lian)接產(chan)物轉(zhuan)化大腸桿菌DH5α，根據(ju)重組(zu)載體的標志（抗Amp或藍白斑）作(zuo)篩選，挑取(qu)單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙(shuang)酶(mei)切初步鑒定。

2、測(ce)序(xu)驗證目的(de)基因的(de)插入方向(xiang)及(ji)閱讀框(kuang)架均正確，進入下步操(cao)作。否則應篩選更多克(ke)隆(long)，重復亞(ya)克(ke)隆(long)或亞(ya)克(ke)隆(long)至不同酶切位點。

3、以此重組質粒DNA轉化表達(da)宿主(zhu)菌的(de)感受態細(xi)胞。

（四）誘導表達

1、挑取(qu)含重組質(zhi)粒(li)的(de)菌(jun)體(ti)單(dan)斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中(zhong)37℃過夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約需3hr）。

3、取(qu)部分液體(ti)作為未誘(you)導的對照組(zu)，余下的加入IPTG誘(you)導劑至(zhi)終濃度(du)0.4mM作為實驗(yan)組(zu)，兩組(zu)繼續(xu)37℃震蕩培養3hr。

4、分(fen)別(bie)取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重(zhong)懸，混勻，70℃10min。

5、離心12000g×1min，取(qu)上清作為樣品，可(ke)做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇(ze)表(biao)達(da)(da)(da)載體時，要根據所表(biao)達(da)(da)(da)蛋白(bai)的(de)終應用(yong)考(kao)慮(lv)。如為(wei)方(fang)便純(chun)化，可選擇(ze)融(rong)合(he)(he)表(biao)達(da)(da)(da)；如為(wei)獲得(de)天(tian)然蛋白(bai)，可選擇(ze)非融(rong)合(he)(he)表(biao)達(da)(da)(da)。

2、融合表達時在(zai)選擇外源(yuan)DNA同載體分(fen)子連(lian)接反應(ying)時，對(dui)轉(zhuan)錄(lu)和(he)轉(zhuan)譯過程中密(mi)碼(ma)結構(gou)的閱讀不能(neng)發生干擾。